코로나 바이러스는 RNA 바이러스이고, PCR DNA 증폭기술이기 때문에, RNA로부터 DNA를 만드는 역전사(reverse transcription) 단계를 추가한 reverse transcription PCR (RT-PCR)이 사용됩니다. 


RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)

 


<그림 4 RT-PCR의 단계>


Real-time PCR, Quantitative PCR (qPCR)

진단에 사용되는 qPCR(quantitative PCR 또는 real time PCR)은 실시간으로 DNA가 증폭하는 양을 확인할 수 있는 기술입니다. Real-time PCR PCR반응을 위한 thermal cycle과 반응물의 detection을 위한 Fluorometer를 결합한 기술이라고 할 수 있는데, SNP typing, 유전자 조작 식품의 검사, 바이러스나 병원균의 검출, 도입 유전자의 copy 수 해석 등 다양한 용도에 적용됩니다. 


Real-time PCR은 형광물질로 표지한 PCR 산물의 증폭량을 실시간으로 신속하게 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동에 의한 PCR 산물의 확인이 필요없이 핵산의 초기량을 정확하게 정량 해낼 수 있는 방법입니다

 

그림에서 보듯, 프라이머에 추가하여 다른 염기 서열인 '프로브'를 붙이는데, 프로브는 염기 서열에 추가로 형광물질 '리포터'와 형광을 흡수하는 '퀜처'가 있습니다. 프로브가 붙었다가 PCR이 진행되면서 DNA 염기를 하나씩 붙이는 DNA Taq Polymerase에 의해 프로브가 분해되면 리포터와 퀜처가 떨어지고, 그 때부터 형광 물질이 빛을 냅니다. 형광 빛의 세기를 측정하여 복제량을 실시간으로 측정하는 방법이 양적(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR입니다.


Real-time PCR법에서는 전체 반응을 추적하기 위해 형광표지물질을 사용하며 이러한 형광물질은 증폭의 매 주기마다 산물이 축적됨에 따라 비례하게 된다. 증폭의 초기에는 형광의 증가가 감지되지 않으나 일정 cycle이 지나면서 축적된 형광량이 기기에 감지되고, 감지되는 시점의 cycle 수를 감지 시작 주기(threshold cycle) 라고 합니다.


주형(template) 초기량의 log값과 threshold cycle 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지기 때문에 초기량을 알고 있는 핵산을 이용하여 초기량의 log값과 그에 해당하는 threshold cycle을 이용하여 표준 검량 곡선을 얻을 수 있고, 이 표준 검광곡선을 이용하면 미지 시료에 대한 초기량을 정확하게 계산해낼 수 있습니다.


코로나19 바이러스 검출방법

코로나19 바이러스의 검사는 우선 의심환자에게서 Target 검체를 채취한 뒤 신종 코로나바이러스에 특이적으로 디자인된 Antisense Primer를 사용하여 RT-PCR의 증폭여부로 환자의 감염 여부를 구분합니다. 


 

사용하는 Antisense Primer RdRp(RNA-dependant RNA polymerase) Enzyme 부분과 E gene (Envelop 단백질 유전자) 부분입니다.

 

KASAN_코로나19 감염여부 진단방법 - Real-time Reverse Transcription PCR, rRT

 

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작성일시 : 2020. 3. 5. 17:18
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-- 의료기기 PNA (Peptide Nucleic Acid) 칩 진단세트 사용 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검사 분쟁사례: 서울고등법원 2015. 9. 22. 선고 201468661 판결 --

 

PNA (Peptide Nucleic Acid) 칩이 부착된 탐침을 이용한 “인유두종바이러스 유전자형 검사[HPV Genotyping(DNA Microarray Test)]”를 간강보험급여 대상 신의료 기술로 볼 것인 것 여부에 관한 판결입니다.

 

국내 바이오 벤처에서 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 판별용 PNA 칩을 개발해 2010년부터 판매했고, 여러 병원에서 위 Chip을 사용하여 인유두종바이러스 감염 여부를 검사하고, 건보공단에 요양급여를 청구하여 지급받았습니다. PNA 칩 진단제품을 이용한 검사행위가 국민건강보험 요양급여의 기준에 관한 규칙 제8조 제1항 제1호 및행위급여·비급여목록표 및 상대가치점수에서 요양급여 대상으로 인정한 분자병리검사인유두종바이러스 유전자형 검사에 해당한다는 입장입니다.

 

그런데, 국민건강보험공단은 2013년 말부터 요양급여비용 환수처분을 시작했고, 이에 불복한 병원과 벤처회사에서 건보공단 환수처분의 취소를 구하는 행정소송을 제기한 것입니다. 대법원까지 가는 치열한 소송은 행정법원, 서울고등법원, 대법원 모두 국민건강보험공단의 주장을 배척하고 벤처회사와 병원의 손들 들어주는 것으로 종결되었습니다.

 

건강보험관련 복잡한 쟁점이 많지만 주요 판결요지는 다음과 같습니다. "기존에 보험급여대상이었던 의료기술에 관하여 신의료기술결정이 내려졌다는 사정만으로 그 신의료기술결정이 위법하다고 단정할 수 없으며, 신의료기술결정이 내려졌다고 하여 반드시 기존에 행해졌던 의료행위가 소급하여 보험급여대상에서 제외되는 것은 아니다. 국민건강보험법 제57조 제1항 및 의료급여법 제23조 제1항의 ‘속임수 기타 부당한 행위로 급여비용을 받은 경우’는 급여비용을 받은 자가 주관적으로 속임수나 기타 부당한 방법임을 인식하면서도 적극적으로 받을 수 없는 급여비용을 받은 경우를 말하며, 해당 의료행위가 보험급여대상으로 오인할만한 정당한 이유가 있었던 경우에는 이에 해당하지 않는다."

 

한편, 기술적 측면에서 최근 보도자료를 참고로 소개합니다. PNA 칩 기술을 활용하여 10시간 이내에 식중독 원인균을 정확하게 판별하는 신기술을 개발했다고 합니다. 아래 그림을 보면 그 기술적 개요를 짐작할 수 있습니다.

 

첨부: 서울고등법원 2015. 9. 22. 선고 201468661 판결

서울고등법원 2014누68661.pdf

 

작성일시 : 2016. 6. 10. 13:17
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