1. 정식승인 분자진단법: Real-time Reverse Transcription PCR, rRT-PCR, RT-qPCR, qRT-PCR 기술

 

2. 신속진단법 항원(Ag)검사 면역진단법 OT 항체(Ab)검사 면역진단법

 

 

 

신속진단법은 항원-항체 면역반응과 크로마토그래피의 원리를 결합한 기술. 신속진단키트에 미리 도포하여 접착한 항원 또는 항원과 검사시료 중의 특정 항체 또는 항원의 면역반응을 통해 해당 항원 Ag 또는 항체 Ab의 존재여부를 확인할 수 있는 의료기기.

 

3. 미국감염학회에 공개된 중국 연구진의 비교실험 논문 - Profiling Early Humoral Response to Diagnose COVID-19

 

 

 

21일 미국 감염학회 홈페이지에 게재된 논문 내용. 중국 연구진은 확진자 82명과 코로나19 소견이 보이나 PCR 검사에서 음성 판정을 받은 환자 53명의 혈장 샘플 208개를 분석한 결과 분석. PCR 분자진단법과 항체 면역검사법은 그 검사 시기에 따라 정반대의 프로파일을 보임.

 

 

검사기간 25일을 기준으로 PCR 검사와 항체검사 면역진단법을 함께 병행하는 경우 코로나19 감염여부에 관한 진단의 정확도가 51.9%에서 98.6%로 높아지는 것으로 보고함.

 

KASAN_코로나19, COVID-19 감염여부 진단의 정확도 관련 최근 연구결과 – PCR 분자진단법과 Ab 항체

 

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작성일시 : 2020. 3. 23. 18:00
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코로나 바이러스는 RNA 바이러스이고, PCR DNA 증폭기술이기 때문에, RNA로부터 DNA를 만드는 역전사(reverse transcription) 단계를 추가한 reverse transcription PCR (RT-PCR)이 사용됩니다. 


RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)

 


<그림 4 RT-PCR의 단계>


Real-time PCR, Quantitative PCR (qPCR)

진단에 사용되는 qPCR(quantitative PCR 또는 real time PCR)은 실시간으로 DNA가 증폭하는 양을 확인할 수 있는 기술입니다. Real-time PCR PCR반응을 위한 thermal cycle과 반응물의 detection을 위한 Fluorometer를 결합한 기술이라고 할 수 있는데, SNP typing, 유전자 조작 식품의 검사, 바이러스나 병원균의 검출, 도입 유전자의 copy 수 해석 등 다양한 용도에 적용됩니다. 


Real-time PCR은 형광물질로 표지한 PCR 산물의 증폭량을 실시간으로 신속하게 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동에 의한 PCR 산물의 확인이 필요없이 핵산의 초기량을 정확하게 정량 해낼 수 있는 방법입니다

 

그림에서 보듯, 프라이머에 추가하여 다른 염기 서열인 '프로브'를 붙이는데, 프로브는 염기 서열에 추가로 형광물질 '리포터'와 형광을 흡수하는 '퀜처'가 있습니다. 프로브가 붙었다가 PCR이 진행되면서 DNA 염기를 하나씩 붙이는 DNA Taq Polymerase에 의해 프로브가 분해되면 리포터와 퀜처가 떨어지고, 그 때부터 형광 물질이 빛을 냅니다. 형광 빛의 세기를 측정하여 복제량을 실시간으로 측정하는 방법이 양적(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR입니다.


Real-time PCR법에서는 전체 반응을 추적하기 위해 형광표지물질을 사용하며 이러한 형광물질은 증폭의 매 주기마다 산물이 축적됨에 따라 비례하게 된다. 증폭의 초기에는 형광의 증가가 감지되지 않으나 일정 cycle이 지나면서 축적된 형광량이 기기에 감지되고, 감지되는 시점의 cycle 수를 감지 시작 주기(threshold cycle) 라고 합니다.


주형(template) 초기량의 log값과 threshold cycle 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지기 때문에 초기량을 알고 있는 핵산을 이용하여 초기량의 log값과 그에 해당하는 threshold cycle을 이용하여 표준 검량 곡선을 얻을 수 있고, 이 표준 검광곡선을 이용하면 미지 시료에 대한 초기량을 정확하게 계산해낼 수 있습니다.


코로나19 바이러스 검출방법

코로나19 바이러스의 검사는 우선 의심환자에게서 Target 검체를 채취한 뒤 신종 코로나바이러스에 특이적으로 디자인된 Antisense Primer를 사용하여 RT-PCR의 증폭여부로 환자의 감염 여부를 구분합니다. 


 

사용하는 Antisense Primer RdRp(RNA-dependant RNA polymerase) Enzyme 부분과 E gene (Envelop 단백질 유전자) 부분입니다.

 

KASAN_코로나19 감염여부 진단방법 - Real-time Reverse Transcription PCR, rRT

 

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작성일시 : 2020. 3. 5. 17:18
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-- 바이오마커, 진단방법, 치료방법 등 바이오, 의약분야 특허대상 적격 판단 examples - USPTO 2016. 5. 6. 공표 Guidelines -- 

 

Example 29

 

“Jilitis”라는 가상 질병과 이에 대한 마커로서 가상의 단백질인 “JUL-1”을 이용한 가상의 특허청구항을 가정하고, 특허대상 적격성을 설명하고 있습니다.

 

[배경기술 등 참고사항]

1. 특허출원 전에 돼지의 항체(porcine antibody)를 가축의 치료제로 사용하는 것은 대부분의 과학자들에게 일반적이었지만, 인간 단백질(JUL-1)을 검출하기 위해 사용하는 것은 일상적이거나 전통적이지(routinely or conventionally) 않았습니다.

2. 특허출원 전에 julitis 치료를 위해 TNF 항체를 사용했습니다. 하지만 julitis 치료를 위해 vitamin D를 사용하는 것은 일반적이거나 일상적이지 않았습니다.

 

Claim Example

1. A method of detecting JUL-1 in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient; and

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample by contacting the plasma sample with an anti-JUL-1 antibody and detecting binding between JUL-1 and the antibody.

 

- 그 방법이 매우 일반적인 내용을 포함하고 있는 경우에도 새롭게 동정된 단백질 마커를 검출하는 방법은 특허대상 적격성 인정 특허 유효

 

2. A method of diagnosing julitis in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient;

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample by contacting the plasma sample with an anti-JUL-1 antibody and detecting binding between JUL-1 and the antibody; and

c. diagnosing the patient with julitis when the presence of JUL-1 in the plasma sample is detected.

 

- 그 검출 단계가 매우 일반적인 경우 새롭게 동정된 단백질 마커를 검출하는 방법에 의해 질병을 진단하는 방법은 특허대상 적격성 불인정 등록거절 및 특허무효

 

3. A method of diagnosing julitis in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient;

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample by contacting the plasma sample with a porcine anti-JUL-1 antibody and detecting binding between JUL-1 and the porcine antibody; and

c. diagnosing the patient with julitis when the presence of JUL-1 in the plasma sample is detected.

 

4. A method of diagnosing julitis in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient;

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample by contacting the plasma sample with antibody mAb-D33 and detecting binding between JUL-1 and antibody mAb-D33; and

c. diagnosing the patient with julitis when the presence of JUL-1 in the plasma sample is detected.

 

- 그 검출 단계가 매우 일반적인 경우에도 신규하거나 최소한 잘 알려져 있지 않고, 일상적이거나 전통적이지 않은물질을 이용하는 경우에는 새롭게 동정된 단백질 마커를 검출하는 방법에 의해 질병을 진단하는 방법은 특허대상 적격성 인정 {Claim 3, Claim 4} – 특허유효

 

5. A method of diagnosing and treating julitis in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient;

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample;

c. diagnosing the patient with julitis when the presence of JUL-1 in the plasma sample is detected; and

d. administering an effective amount of topical vitamin D to the diagnosed patient.

 

6. A method of diagnosing and treating julitis in a patient, said method comprising:

a. obtaining a plasma sample from a human patient;

b. detecting whether JUL-1 is present in the plasma sample;

c. diagnosing the patient with julitis when the presence of JUL-1 in the plasma sample is detected; and

d. administering an effective amount of anti-tumor necrosis factor (TNF) antibodies to the diagnosed patient.

 

- 그 검출 단계가 매우 일반적이고 치료방법이 전통적인 경우에도 새롭게 동정된 단백질 마커를 검출하는 것을 포함하는 개인 맟춤형(personalized medicine) 진단 및 치료방법은 특허대상 적격성 인정 {Claim 5, Claim 6} – 특허유효

 

7. A method of treating a patient with julitis, the method comprising administering an effective amount of anti-TNF antibodies to a patient suffering from julitis.

 

- 질병을 치료하는 방법은 특허대상 적격성 인정 {Claim 7} – 특허유효

 

Example 31 - Myriad U.S. Patent 5,753,441를 이용한 예시입니다. 1항은 실제 청구항(CAFC에서 무효판단)이고, 70, 75, 80, 85항은 가상의 청구항입니다.

 

[이해를 위한 참고사항]

1. scanning near-field optical microscopy를 이용하여 DNA hybridization을 검출하는 것은 특허출원 당시 일반적인 방법이 아니었음.

2. Cool-Melt PCR(가상의 기술임)은 특허출원 당시 일반적인 기술이 아니었음.

 

Claims

1. A method for screening germline of a human subject for an alteration of a BRCA1 gene which comprises comparing germline sequence of a BRCA1 gene or BRCA1 RNA from a tissue sample from said subject or a sequence of BRCA1 cDNA made from mRNA from said sample with germline sequences of wild-type BRCA1 gene, wild-type BRCA1 RNA or wild-type BRCA1 cDNA, wherein a difference in the sequence of the BRCA1 gene, BRCA1 RNA or BRCA1 cDNA of the subject from wild-type indicates an alteration in the BRCA1 gene in said subject.

 

70. The method of claim 1, wherein said comparing BRCA1 sequences further comprises:

hybridizing a wild-type probe to a BRCA1 gene isolated from said sample; and

detecting the presence of a hybridization product by measuring conformational changes in the probe that are indicative of hybridization to the BRCA1 gene with scanning near-field optical microscopy.

 

75. A method for hybridizing BRCA1 sequences comprising:

hybridizing a wild-type probe to a BRCA1 gene isolated from a tissue sample from a human subject; and detecting the presence of a hybridization product by measuring conformational changes in the probe that are indicative of hybridization to the BRCA1 gene with scanning near-field optical microscopy.

 

80. The method of claim 1, wherein said comparing BRCA1 sequences further comprises:

amplifying by Cool-Melt PCR all or part of a BRCA1 gene from said sample using a set of primers to produce amplified nucleic acids; and sequencing the amplified nucleic acids.

 

85. A method for amplifying BRCA1 sequences comprising:

amplifying by Cool-Melt PCR all or part of a BRCA1 gene from a tissue sample from a human subject using a set of primers to produce amplified nucleic acids; and sequencing the amplified nucleic acids.

 

[특허대상 적격성 판단]

 

- 서열을 비교(comparing)”하는 것에 기초한 스크리닝 방법은 그 비교가 매우 일반적인경우(예컨대, 일반적인 정신적인 프로세스로 여겨질 수 있는) 특허대상 적격성 불인정 {Claim 1} – 특허무효

- 스크리닝 방법이 잘 알려져 있지 않고, 일상적이거나 전통적이지 않은기술을 이용하는 경우 특허대상 적격성 인정 {Claim 70, Claim 75, Claim 80, Claim 85} – 특허유효

 

첨부: USPTO 공표자료

  USPTO_2016_May.pdf

 

김용하 변호사

작성일시 : 2016. 5. 10. 17:01
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-- Biomarker 및 진단방법 특허발명 관련 미국특허소송 판결 -- 

 

Biomarker 및 진단방법 특허에는 어려운 쟁점이 많습니다. 현재뿐만 아니라 상당한 시일이 지나 실제 적용될 미래에 특허법리가 어떻게 발전할지, 국내뿐만 아니라 미국 등 외국의 특허법리상 어떤 취급을 할지 등을 고려한 전략적 판단이 필요하다 생각합니다.

 

새로운 내용은 아니지만 참고자료로 2016. 2. 23. 나온 미국특허소송 판결을 소개합니다. 특허권자 Cleveland Clinic Foundation에서 True Health Diagnostics라는 회사를 상대로 제기한 특허침해소송에서 대상특허는 U.S. Patents No. 7,223,552, 7,459,286, 8,349,581인데, 모두 심장질환 cardiovascular disease (CVD) 발병과 연관된 혈관염증으로 생성되는 효소 Myeloperoxidase (MPO)의 혈중농도를 측정하여 심장질환을 조기 진단할 수 있는 방법특허입니다.

 

1심 재판부 미국연방지방법원 판사는 CVD 위험성과 MPO level은 자연현상인데, 이를 측정하여 정상 값과 비교하여 심장질환 발명의 위험성을 판단하는 것만으로는 특허권 부여대상으로서 충분하지 않다고 판단하였습니다. 미국연방대법원의 Mayo 판결 등 종래 판례법에 따른 판결입니다.

 

아래 인용하는 특허등록청구항 중 하나를 보면, 특허발명 진단방법의 요지를 쉽게 파악할 수 있습니다.

 

Claim: A method of determining whether a patient who presents with chest pain is at risk of requiring medical intervention to prevent an adverse cardiac event within the next six months comprising:

 

comparing the level of a risk predictor in a bodily sample from the subject with a value that is based on the level of said risk predictor in comparable samples from a control population,

 

wherein said risk predictor is myeloperoxidase activity, myeloperoxidase mass, a myeloperoxidase-generated oxidation product, or any combination thereof, and wherein said bodily sample is blood, serum, plasma, or urine,

 

wherein a subject whose bodily sample contains elevated levels of said risk predictor as compared to the control value is at risk of requiring medical intervention to prevent an adverse cardiac event within 6 months of presenting with chest pain, and wherein the difference between the level of the risk predictor in the patient's bodily sample and the level of the risk predictor in a comparable bodily sample from the control population establishes the extent of the risk to the subject of requiring medical intervention to prevent an adverse cardiac event within the next six months.

 

첨부: 미국특허소송 판결 (2016. 2. 23.)

Cleveland Clinic v True Health.pdf

작성일시 : 2016. 2. 26. 09:17
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